Gillan wuchs im schottischen Inverness auf. Ihre Eltern leben in Kinmylies. Im Alter von 16 Jahren entschied sie sich, am Telford College in Edinburgh Schauspielunterricht zu nehmen. Später sicherte sie sich einen Platz an der Italia Conti Academy of Theatre Arts in London.
Gillan hatte ihre erste Rolle in Rebus, während sie noch an der Italia Conti studierte. Weiter spielte sie unter anderem in The Kevin Bishop Show, Stacked und James Nesbitts Film Outcast. Zeitweise modelte sie, so zum Beispiel 2007 auf der London Fashion Week für Allegra Hicks’ Herbst-/Winter-Kollektion.
Matt Smith (Doctor Who) und Karen Gillan vor der TARDIS (2010) Von 2010 bis 2012 spielte Gillan die Rolle der Amy Pond – der Begleiterin des elften Doktors – in der britischen Kult-Fernsehserie Doctor Who. Diese Rolle spricht sie auch in den Doctor-Who-Computerspielen. Gillan war bereits 2008 in der Doctor-Who-Episode The Fires of Pompeii in einer Nebenrolle zu sehen. Es handelte sich um die gleiche Folge, in der auch Peter Capaldi, der später den zwölften Doktor verkörperte, eine Nebenrolle innehatte.
2014 war sie als Cyborg-Kriegerin Nebula in Guardians of the Galaxy zu sehen. In der 2017 erschienenen Fortsetzung Guardians of the Galaxy Vol. 2 und 2018 in Avengers: Infinity War übernahm sie diese Rolle erneut. Dazwischen übernahm sie in Jumanji: Willkommen im Dschungel eine der fünf Hauptrollen.
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